白血病的诊断与分型(一)

一、白血病诊断与分型及其相关技术概述

白血病是一组造血干/祖细胞恶变导致分化阻滞、凋亡障碍的异质性恶性肿瘤性疾病。绝大多数表现为骨髓(BM)和/或血液(PB)中的恶性造血系统或免疫系统细胞增加。

为了能指导临床及科研，疾病的分型应有较好的重复性，并能反映疾病亚型的生物学及临床特征，帮助判断预后，指导制定治疗方案及治疗策略，监测疗效，确定停止治疗的时机。正常时所有的血细胞，如粒、单核、红、淋巴细胞，以及血小板均来自BM的造血干细胞(HSC)。不同型白血病是造血干/祖细胞分化受阻于不同阶段的结果，具有与正常造血细胞相对应的形态学、细胞化学、免疫学表型特征。但与正常细胞相比，有一些特征发生异常，以这些特征为依据，我们可以对白血病进行诊断及分型。

根据白血病细胞分化受阻的成熟阶段及病程将白血病分为急性和慢性两大类。急性白血病细胞分化阻滞在较早阶段，故大部分细胞为原始细胞或异常早幼粒细胞，而慢性白血病细胞具有较大程度的分化成熟能力，大部分细胞为形态较正常的成熟细胞。根据白血病细胞的系列来源将其分为髓系及淋巴细胞系两大类，前者包括红、粒、单核、巨核细胞系白血病，后者包括T、B淋巴细胞系白血病。

光镜及电镜下观察细胞形态及细胞化学染色是白血病诊断与分型的基础方法。1976年，法、美、英三国的专家组成了FAB白血病分型协作组，提出了急性白血病的诊断标准及分型意见(Bennett等，1976)，以后进行了多次修改补充(Bennett等，1991，1985a，1985b，1981，1980)。FAB的分型简单，易于在基层单位推广。但尚存在较多的不完善之处：其重复性较差，只有60%～70%，对预后判断、疗效监测、指导治疗的价值也不太大。随着免疫学、细胞遗传学及分子遗传学、分子生物学的发展，甚至对疾病发病原因更深入的了解，发现综合多种方法对白血病进行诊断和分型重复性更好、更客观，且更能反映疾病亚型的生物学及临床特征，能更好地帮助判断预后，指导制定治疗方案及策略，监测疗效。

从1995年开始，卫生组织(WHO)成立了一个指导委员会，提出恶性血液及淋巴系统疾病的统一诊断与分型标准，分别于2001年、2004年、2008年修订。白血病诊断与分型进入了整合诊断与分型的时代。WHO提出，在患者初次就诊时，只要条件许可，尽可能给患者进行全面的检查评估，除了全面病史、体格检查、生化、三大常规、按病情所需进行的其它检查外，特别要进行形态学、免疫学、细胞遗传学与分子遗传学、分子生物学，甚至病原学的检测。

形态学分型技术包括以下两方面，不同白血病原始细胞的形态和细胞化学染色见表1-1。(1)对PB涂片、BM穿刺液涂片，用瑞氏-姬姆萨或梅-格瑞-姬姆萨(May-Grunwald-Giemsa)染色后在光镜下观察形态。为了减少误差，WHO(2008)要求观察>；500个骨髓细胞，>；200个血液细胞，还需要观察多张涂片的细胞来综合报告。多种细胞化学染色反应也可帮助鉴别不同系列来源或不同成熟阶段的细胞。对特殊患者甚至用电镜观察其超微结构及其细胞化学染色反应，一些光镜下阴性的细胞在电镜下可能阳性；不同细胞的超微结构染色反应不同，如髓过氧化酶(MPO)在原粒细胞的A颗粒粗面内质网、高尔基体和核膜均为阳性；血小板MPO(PPO)在原巨核细胞的内质网及核膜呈阳性，而高尔基体及颗粒阴性。(2)对BM活检切片经不同染色后观察。骨髓活检病理检查有以下方面的特殊作用：能更好地反映骨髓细胞的增生程度、细胞在组织结构中的定位、造血细胞的比例及成熟度、基质情况、是否合并纤维化，组织结构是否被破坏，活检标本尚可用于IHC检测。如果由于骨髓干抽等原因不能获得骨髓涂片，还应用骨髓活检标本印片观察细胞形态。对于有骨髓纤维化、骨髓穿刺困难的患者，骨髓活检尤其重要。

免疫学分型主要包括免疫组织化学染色技术(IHC)、流式细胞分析技术(FCM)。采用不同染料或荧光染料标记的单克隆抗体(mAb)对细胞悬液、细胞涂片或BM组织切片进行染色，然后在流式细胞仪或荧光显微镜或光镜下观察细胞表面或细胞内的抗原标记。一般说来，白血病细胞与正常造血细胞的抗原标志相近。由于不同成熟阶段和不同系列来源的细胞表达不同的抗原标志，因此分析白血病细胞的抗原标志比形态学方法更易区分恶性细胞的系列来源及成熟阶段。由于白血病细胞与正常造血细胞不同，有抗原表达紊乱、或紊乱分布的现象，因此免疫分型比细胞形态更易帮助鉴别细胞的良恶性，特别是对细胞形态较正常的外周(或成熟)的白血病。免疫学标志分析结合细胞形态及细胞化学染色方法，可将90-99%的急性髓性白血病(AML)与急性淋巴细胞白血病(ALL)区分开来(SecondMIC，1988)，重复性可提高至99%。一些白血病，尤其是多系列白血病、微分化型白血病的诊断在很大程度上依赖免疫分型技术。通过组合分析多种标志的表达、强弱、是否紊乱等，FCM可帮助确立监测残留白血病(MRD)的标志，用FCM监测MRD的敏感性可达10-3~10-4。由于一些单克隆抗体(如抗CD20、CD52、CD33、CD19、CD22等的单抗)已经分别用于临床治疗这些抗原阳性的白血病，所以免疫分型还可以帮助指导单克隆抗体为基础的靶向治疗。有些免疫标志阳性的白血病预后不好(如CD34+CD56+的AML预后不好)，因此免疫分型尚有一定的预后意义。因为很多免疫标志在正常细胞上也存在，因此进行白血病免疫分型时应该确定免疫标志在白血病细胞上，而不是简单地根据某一免疫标志的阳性细胞&ge；20%。例如，当原始白血病细胞只有20%，而正常粒细胞高达&ge；50%时，此时根据粒细胞标志细胞占全部有核细胞的50%就诊断急性粒细胞白血病是完全错误的。

染色体分析(细胞遗传学分析)具有独立的预后及指导治疗的价值。如t(15；17)仅见于急性早幼粒细胞性白血病(APL)，对全反式维甲酸(ATRA)、砷剂及蒽环类药物治疗的疗效好，其治愈率可达70-96%。而t(11；17)的APL对ATRA及砷剂的疗效就不如t(15；17)者好。有t(9；22)染色体异常的ALL预后差，用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗效好等。染色体分析对的优点是可同时发现多种染色体异常；缺点是不太敏感、需要细胞活性好、白血病细胞要分裂才能反映其染色体异常，一些微小的染色体异常很难检测出来，需要分析人员有丰富的经验。因此用常规标准的显带和核型分析技术，容易漏检或错误判断一些染色体异常。荧光标记不同染色体或基因片段探针的原位杂交技术(FISH)可以检测很微小的异常，可以检测不分裂的细胞，分析的细胞数目明显比染色体核型分析多，因此大大增加了染色体分析的敏感性和准确性。但是FISH技术使用的探针较昂贵，一次只能检测一种或数种异常，同时检测23对染色体的探针目前还很难常规用于临床诊断，因此，目前FISH主要用几种常见的异常染色体组合探针来诊断常见的染色体异常白血病，更多用于监测治疗后的MRD，其敏感性可达10-3。

随着分子生物学的发展，在白血病患者发现越来越多的融合基因或基因突变。一般来说，白血病融合基因是由染色体移位引起，如t(15；17)产生PML-RARA融合基因，但有时染色体异常为隐匿性异常，用常规的染色体核型分析技术检测不出异常染色体，但用分子生物学方法能检测出相应的融合基因，它们的生物学特性是一样的。比如我们发现染色体正常但BCR-ABL阳性的ALL，与t(9；22)异常的ALL一样对格列卫治疗有效；染色体正常但PML-RARA基因阳性的APL同样对全反式维甲酸及砷剂治疗有效等。目前已发现数百种基因与白血病有关。多重巢氏PCR及基因芯片技术可快速检测数百种白血病基因，这些基因可以帮助白血病的分型、判断预后、指导治疗和监测MRD。用基因扩增方法监测MRD，其敏感性可达10-4～10-6，是目前监测MRD敏感的指标。由于染色体和/或基因的独特价值，WHO分型系统把特殊染色体和/或基因异常的白血病独立分型，大大增加了它们的地位。

越来越多的研究发现，病原感染与某些类型的白血病有关，如成人T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)与成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)有关，EB病毒(EBV)与淋巴系统白血病有关。而这些病原相关的白血病与临床预后及治疗选择都相关。因此病原检测也可能作为白血病(或恶性PB病)的分型指标之一。

由于目前FAB分型仍是基层医院常用的分型标准，而2008年WHO分型是新的分型标准，故在本书中仅介绍这两种分型标准。值得注意的是，WHO已经将恶性血液系统肿瘤分成了髓系、淋巴细胞系等几大类，统称为恶性血液及淋巴系统肿瘤，因为一些淋巴瘤、骨髓增殖性肿瘤(MPN)、骨髓增生异常综合征(MDS)等与白血病只有微小的差异，如淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)与急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)与小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、MDS与一些急性白血病等的生物学特征非常相似，它们的区分仅仅是根据恶性细胞在骨髓和/或血液的比例来确定。因此好全面了解WHO对恶性血液及淋巴系统疾病的全面分型(详见附件)。由于本书主要介绍白血病，故以下仅介绍白血病的诊断与分型。

二、白血病的诊断步骤在诊断白血病时，我们重要的是要注意回答以下几方面的问题。

(一)是正常细胞还是白血病细胞?急性白血病特征是造血前体细胞明显增加，表现为原始细胞大量增加，良恶性细胞较容易鉴别，因为正常人BM的原始细胞一般<；2%，在PB几乎不能发现。所以诊断急性白血病的主要标准是BM和/或PB中原始细胞比例。但是仅通过观察细胞形态来鉴别原始细胞，仅凭原始细胞多少来判断急性白血病可能会导致误诊。有时候形态学观察到的原始或幼稚淋巴细胞可能为正常反应性增生的原始细胞，一些患者在感染或细胞因子治疗后，尤其是在儿童患者，正常原始细胞可能升高；一些形态符合原始或幼稚细胞特征的细胞不是真正的原始细胞，而是成熟的细胞。相反，有时形态学不像原始细胞，而实际上为恶性造血前体细胞。慢性白血病以BM和/或PB中成熟血液系统细胞增加为主要表现，虽然一些细胞的形态有异常，但大多数很难仅凭形态学将良恶性细胞区分开来。因此鉴别良恶性细胞需要结合多种方法。1、形态学及病理方法原始细胞在BM、PB或其它部位明显增加是急性白血病的特征。细胞体积增大，多种核畸形，核胞发育失衡，胞浆含Auer小体、颗粒过多或过少；细胞在骨髓或其它组织定位异常、破坏正常组织结构等。胞浆Auer小体是恶性髓系细胞的特征。2、免疫学方法(1)细胞上抗原表达异常虽然恶性造血或淋巴系统细胞的抗原与正常细胞表达相近，很少有恶性细胞特异的抗原标志，但是恶性细胞的抗原表达紊乱，表现为：一种系列的细胞表达另一系列细胞的抗原；发育早期与晚期的抗原同时表达；本应表达的抗原缺失；抗原表达过强或过弱；罕见标志的细胞明显增多；在血液或其它外周器官中大量细胞上表达仅在胸腺或前体细胞上表达的抗原；细胞大小或细胞颗粒多少变化等。恶性B细胞抗原异常表达包括：一些非B细胞系列的标志如CD13、CD15、CD33、CD117、CD2、CD5、CD7、CD56与B细胞抗原如CD19、CD20、CD22、CD79a、细胞内或膜表面免疫球蛋白(Ig)共表达，而在正常B淋巴细胞上不表达；一些泛B抗原丢失；细胞增大导致前向角(FSC)变大，细胞内颗粒增多导致侧向角(SSC)增高；CD45比正常成熟淋巴细胞明显增强或减弱等。除了以上恶性B细胞的共性外，B-ALL常见的抗原异常表达是CD45、CD38、TdT表达缺乏或很弱；CD10、CD19、CD34表达是正常细胞的10倍。恶性T细胞抗原异常表达包括：大多数仅表达表达CD4或CD8，或CD4+和CD8+共表达，或CD3+的细胞不表达CD4及CD8；常常丢失一些泛T抗原CD2、CD3、CD5、CD7，或表达明显减弱；一些非T细胞系列的标志如CD13、CD15、CD33、CD117、CD56、CD19、CD79a与以上泛T细胞抗原共表达；CD45比正常成熟淋巴细胞明显增强或减弱；FSC、SSC增大。除了以上恶性T细胞的共性外，T-ALL常见的抗原异常表达是cCD3和TdT共表达，或cCD3与34共表达，CD1a与CD34及其它泛T细胞标志共表达。恶性髓系细胞抗原异常表达包括：一些非髓系的抗原如CD2、CD5、CD7、CD56、CD19、CD79a等与髓系抗原共表达；早期细胞的抗原与晚期细胞抗原共表达，如CD34与CD11b或CD14或CD15等共表达；丢失本应该表达的抗原，如在单核细胞上丢失CD14、CD33，在粒细胞上丢失Dr，原始细胞CD45dim或阴性等；CD34、CD117等抗原过度表达；FSC、SSC异常增大或SSC异常缩小。(2)B细胞的克隆性分析由于大多数外周(成熟)B细胞的胞浆内或细胞膜表面表达免疫球蛋白(Ig)，其轻链为&kappa；(kappa)或&lambda；(lambda)，正常B细胞上表达&kappa；与&lambda；的细胞数量比例为3:2。当某一群恶性B淋巴细胞增生时，细胞仅表达&kappa；或&lambda；(单克隆性)；而反应性增生或良性B淋巴细胞表达&kappa；与&lambda；的细胞数量比例为正常(多克隆性)。因此通过检测表达&kappa；或&lambda；细胞的B细胞比例，可以了解细胞是否为单克隆增生的B细胞。当某一群细胞中表达&kappa；与&lambda；的细胞数量比例>；4:1，或<；1:2时，考虑为单克隆增生。图3-2显示了正常与恶性成熟B细胞的&kappa；与&lambda；的特点。用FCM检测快速简便，且容易定位于不同类型的细胞，已被常规用于成熟B细胞的克隆性分析。(1)T淋巴细胞的克隆性分析大多数成熟T细胞表面表达T细胞抗原受体(TCR)&alpha；/&beta；链，其V&beta；区具有多表位的抗原，不同个体该区的抗原有较大的多态性。目前用单抗可识别TCRV&beta；家族的多个表位的抗原，表达不同表位抗原的T细胞比例有一定范围，如某一表位阳性细胞明显增加，而其它表位阳性细胞明显减少，要考虑为克隆性T细胞疾病(图1-4显示患者TCR&alpha；/&beta；链V&beta；区的某一表位细胞明显增加，提示存在恶性T细胞)。目前用TCR-V&beta；家族的抗体对70%以上的恶性成熟T细胞疾病可确定其克隆性，但抗体多，检测费用高，难以普及，目前已基本被TCR基因克隆性重排检测替代，后者便宜。(1)细胞DNA浓度或细胞增殖周期分析恶性淋巴细胞由于染色体丢失或过多，FCM分析DNA的含量可发现细胞为亚二倍体、正常或超二倍体，从而帮助判断细胞的良恶性。FCM可同时标记免疫抗原及DNA，因此可选择不同标记的细胞来分析DNA浓度。通过对DNA及增殖抗原的分析，可以了解恶性细胞处于周期的比例，从而帮助判断恶性淋巴细胞的恶性程度。增殖周期多的细胞进展快，增殖周期少的恶性程度低。3、染色体分析如检测出染色体异常，且排除体质性或遗传性异常，应高度考虑为恶性血液或淋巴系统细胞。4、基因分析白血病常有因染色体易位导致的特有融合基因或基因突变，据此可鉴别良恶性细胞。因为干细胞向淋巴细胞分化过程中，TCR和IgH基因的可变区(V)和结合区(J)基因会发生重排，即两个距离很远的片段重新排列在一起，形成新片段，所以免疫球蛋白重链(IgH)及T细胞受体(TCR)基因重排技术可帮助鉴别淋巴细胞是否为单克隆性增生。每个淋巴细胞都有各自的序列不同的TCR或/和IgH片段。白血病淋巴细胞增殖呈单克隆性，故如果只检测出一种基因重排片段就考虑为单克隆性(图1-5)。临床医生往往把IgH重排当作恶性B细胞肿瘤的标志，而把TCR&gamma；，TCR&delta；重排当作恶性T细胞肿瘤的标志，但IgH、TCR&gamma；、TCR&delta；重排并无系列特异性特征。偶然在AML患者亦可检测到IgH和TCR基因的克隆性重排，即序列失真现象。有时一些非恶性疾病也可能检测到IgH和TCR基因的克隆性重排，尤其是TCR基因重排，如EB病毒感染、移植后使用免疫抑制剂及一些皮肤T细胞良性增殖。检测使用的标本太少也可能导致克隆性重排的假象。诊断时应仔细分析。

(二)是急性(前体)白血病还是慢性(或成熟、或外周)白血病?1、急性白血病的诊断急性白血病又被称为前体细胞白血病，以BM和/或PB中原始细胞增多为主要特征，白血病原始细胞除了有形态学、细胞化学染色特征外，尚须具有前体细胞的免疫标志，造血前体细胞的共同标志是CD34+、TDT+、CD45弱阳性(dim)或阴性，髓系前体细胞为CD117+、CD64+/CD14-，B系前体细胞表达CD10(尚需结合其它)，T系前体细胞CD99+、CD1a+；且有免疫标志异常表达现象。一般来说，急性白血病起病急，数天至数十天起病，常常有血液中红细胞、血小板、正常中性粒减少以及由此引起的临床表现，如贫血、出血、发热等。